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Annexin是一类广泛分布于真核细胞细胞浆内钙离子依赖的磷酯结合蛋白，参与细胞内的信号转导。Annexin V选择性结合磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine，简称PS)，磷酯酰丝氨酸主要分布在细胞膜内侧，即与细胞浆相邻的一侧。在细胞发生凋亡的早期，不同类型的细胞都会把磷酯酰丝氨酸外翻到细胞表面，即细胞膜外侧。磷酯酰丝氨酸暴露到细胞表面后会促进凝血和炎症反应。而Annexin V和外翻到细胞表面的磷酯酰丝氨酸结合后可以阻断磷酯酰丝氨酸的促凝血和促炎症反应活性。本试剂盒用带有红色荧光的荧光探针iFluor594标记的Annexin V，即Annexin V-iFluor594，该红色荧光探针在Ex/Em =590/620处有高稳定性，这种特性使得试剂盒能适合于Texas Red滤光器。本试剂盒和FITC一样可以用流式细胞仪或荧光显微镜非常简单而直接地检测到磷酯酰丝氨酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。本试剂盒提供所有必需组分及流式细胞仪检测是最佳方法。

• 准备细胞及用Annexin V-iFluor 594孵育染色：
  
  • 用药物处理细胞，诱导细胞凋亡（十字孢碱4～6小时诱导Jurkat细胞凋亡）。
    
  • 离心收集细胞，1～5×10⁵cells/管。
    
  • 用200μL Assay Buffer (组分B)重悬细胞；
    
  • 加入2μL Annexin V-iFluor 594（组分A）到上述细胞悬液中；
    
  • 室温，避光孵育30～60分钟；
    
  • 在使用流式细胞仪检测之前可以加入300 Assay Buffer (组分B)重悬细胞，以增加细胞悬液的体积，便于流式细胞仪或荧光显微镜检测。
    
  • 经使用流式细胞仪或荧光显微镜监测Ex/Em = 590/620nm处的荧光强度。
• 流式细胞仪检测分析：
  
  • 对于贴壁细胞，Annexin V流式细胞检测过程中，细胞消化，离心等过程要轻柔，尽量避免人为损伤的细胞，引起假阳性。
  流式细胞仪检测分析使用的波长为：Ex/Em = 590/620nm。
• 荧光显微镜检测分析：
  
  • 对于贴壁细胞，建议直接将细胞接种在盖玻片上。用Annexin V-iFluor 594 (步骤1.e)孵育后，使用Assay Buffer(组分B)冲洗1～2次；再将Assay Buffer (组分B)滴加在盖玻片；然后，将盖玻片倒放在载玻片上（细胞贴近载玻片）。
    
  • 在贴壁细胞用Annexin V-iFluor 594孵育后可以用2%甲醛对细胞进行固定。
  • 用移液器吸取（步骤1.e）细胞悬浮液，使用Assay Buffer (组分B)洗涤1～2次；再用Assay Buffer (组分B)
    重悬细胞，然后，将细胞悬液滴加到载玻片上，并用盖玻片封片。
    
  • 在荧光显微镜下通过Violet channel检测Annexin V-iFluor 594荧光强度，分析细胞凋亡情况；通过TRITC channel检测propidium iodide荧光强度，分析细胞活性情况。细胞质膜上的红色染色说明了Annexin V-iFluor 594结合了细胞表面的磷酯酰丝氨酸。